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基因组|基因组测序在患有罕见、未确诊或遗传性疾病的婴幼儿中的应用

遗传性疾病婴幼儿基因组

来源公众号「基因检测与解读」
2017年 ， 全球基因组计划宣称全世界范围内约有3.5亿人患有罕见病 。 这些疾病对于个人来说是罕见的 ， 但是在人群中的比例占到了4%-8% 。 有研究对>3800个来自于孤儿院患罕见病的婴幼儿的治疗显示其中约80%的患者患有遗传相关性疾病 。 在患有遗传性疾病的患者中 ， 儿童占了将近一半 ， 其中30%的儿童不能活过15岁 。
儿科住院治疗的病人中 ， 很大一部分是由于出生缺陷及罕见遗传性疾病 ， 这给患者、家庭及医疗卫生系统都带来了很大的挑战 。 一项对美国儿童住院的回顾研究中表明 ， 患有慢性复杂疾病的儿童相对于患其他疾病的儿童来说治疗费用会高出11倍 。
西澳洲的一项研究表明 ， 患有罕见病的患者在人群中占2%左右 ， 但是在医院总收费中占到了10.6% 。 有研究最近使用2012年的数据对美国儿科住院费用进行了分析 ， 发现患有罕见疾病的新生儿的平均总费用高达77000美元 ， 年龄较大的儿童高达17000美元 ， 并且这些孩子的住院时间更长 ， 死亡率也更高 。
由于对特定的遗传性疾病如果仅基于临床表型很难予以确诊 ， 因此对于婴幼儿来说应用相关的遗传学检测手段无论是对于诊断还是治疗都是非常重要的 。
在过去的25年里 ， 对于判断患者是否需要进行遗传学诊断已经取得了很大的进步 ， 与此同时 ， 对越来越多的疾病进行简单和经济有效的检测的能力也在不断增加 。
美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）公布了使用基因组测序方法的病例的指征 ， 以及讨论通过基因和基因组检测进行病因诊断的临床应用的政策声明 。 在多种临床诊断评估中应该考虑应用遗传或者基因组测序方法 ， 比如当一个病人极有可能患有遗传病 ， 但是单个的基因诊断或者特异的靶向检测并不能予以确诊的时候就可以考虑使用基因组测序 。
在这个想法的基础上 ， 列表1提出了一些额外的遗传疾病的一般特征 ， 非专业人士可以使用这些特征来帮助识别何时进行基因组检测可能是合适的（列表1） 。
【基因组|基因组测序在患有罕见、未确诊或遗传性疾病的婴幼儿中的应用】列表1基因组测序指征
在NGS被推广之前 ， 有几种技术被用于遗传性疾病基础的鉴定 。 其中最古老的就是G显带核型分析技术 ， 这种技术能检测到染色体结构及数目的异常 ， 也可以进行嵌合体的诊断 。 然而当异常片段低于5-10Mb时 ， 一般检测不出来 ， 因此其诊断率很低 。
20世纪90年代初 ， 荧光原位杂交技术（FISH）得到了发展 。 FISH对染色体异常检测的分辨率要高于G显带技术 ， 有助于疾病中染色体亚显微结构异常的检测 。 但是FISH检测仅限于那些可以被FISH探针杂交上的染色体区域 ， 并且如果异常片段小于50-300kb就很难被检测到 。
染色体微阵列（CMA）在很大程度上取代了核型和FISH ， CMA可以同时检测所有染色体的拷贝数不平衡变异 ， 有时候还可以检测到单亲二倍体 。 CMA的应用显示细胞遗传水平的亚显微结构异常是出生缺陷和新生儿神经性疾病的重要原因 。 当对患有遗传性疾病的儿童进行评估时 ， CMA一般推荐为一线的检测手段 ， 并且根据不同的临床指征CMA对多重先天性异常和发育迟缓的诊断率介于15%-20%之间 。 不同的CMA平台会影响异常检测的范围 。 相对于传统的比较基因组杂交（aCGH） ， 基于单核苷酸多态性的微阵列（SNP arrary）技术对于特定基因的检测率会下降 ， 但是对于拷贝数变异（CNV）的检测以及具有临床意义的拷贝数中性异常（比如单亲二倍体及近亲）的检测有优势 。 CMA不能检测染色体平衡重排 ， 比如平衡异位以及倒位 。 1977年发展的Sanger测序技术可以检测到单核苷酸变异（SNVs）及小的插入和缺失 。
ACMG确认 ， 对遗传性疾病的最终诊断对个人具有临床应用价值 。 考虑到诊断的潜在用途 ， 这些标准技术的局限性引起了极大的关注 ， 并构成了对疑似遗传病患者的管理进展的主要障碍 。 比如 ， CMA对儿科中患有常见病比如ASD或者DD的诊断率是很低的（平均分别为9.3%-13.1%） ， 并且CMA对患有其他常见但特异性不强的疾病（比如非综合征性的出生缺陷）的患者的诊断率有可能更低 。
对患有罕见遗传性疾病的儿童（特别是进入新生儿重症监护病房的危重新生儿和进入其他重症监护病房的儿童）来说 ， 诊断时间是一个需要考虑的重要指标 。 遗传疾病在这一群体中可能很少有具体的临床特征 ， 许多新生儿在确诊前死亡或被遗弃 。 不幸的是 ， 标准的基因检测策略通常包括一系列的检测 ， 这些检测可能需要几周甚至几个月才能完成 。 诊断性评估通常包括多次专家会诊、实验室检查、影像学检查和组织活检 。
当前的基因组医学在疾病诊断和管理中以从WES和全基因组测序获得的信息为特征 。 基于NGS的大的基因测序panels以及WES已经改变了新的致病基因被发现的方式 ， 同时也缩短了诊断的时间 。 迄今为止 ， WES已被广泛应用于临床和研究 。 千人基因组计划以及其他国家项目都在大规模应用GS 。 首次将NGS用于罕见疾病研究时 ， 发现了导致Freeman-Sheldon综合征、Miller综合征和Schinzel-Giedion综合征的基因 ， 它的临床效用在一位患者身上得到了证实 ， 这位患者在经NGS确诊之后接受了骨髓移植从而挽救了生命 。 现在 ， 每年有超过180个与罕见疾病有关的新基因加入到已知致病基因的名单中 ， 但是这种发现的速度可能会停滞不前 。 今后 ， 将要加强对那些用常见的技术不能诊断或者需要联合使用各种检测技术进行诊断的罕见病的遗传诊断评估的完整性（对所有致病性等位基因进行鉴定） 。 由于GS能够弥补这些缺陷 ， 它具有能更有效地提高罕见病的诊断率的潜力 。
线粒体疾病是一种表型和遗传异质性都很强的疾病 ， 因此诊断非常具有挑战性 。 基于NGS针对线粒体基因检测的技术能够诊断常见和罕见线粒体SNVs和缺失 。 基于NGS的技术也可以检测传统的技术比如Sanger测序不能检测到的低水平的异质性改变 。 NGS已经被开发为可以用于线粒体基因组以及会导致线粒体疾病的核基因的评估 。 通常在进行基于NGS的线粒体基因组分析之后再进行WES分析是比较有效的 。 在一项研究中 ， 在20%病人的线粒体基因组中发现了致病性变异 ， 接着应用WES对核基因组分析为另外49%的患者诊断出遗传学病因 。 全基因组测序数据（包括线粒体基因组和所有WES检测出的数据）使得其成为针对线粒体疾病的一种有效的检测方式 。 适用于核基因组变异识别的30-40×的全基因组测序 ， 在线粒体基因组中可以达到5000-9000× ， 这就使得其本身比较适用于线粒体SNVs分析 。
对于患有罕见、未确诊或遗传疾病的儿科和新生儿群体 ， 由于疾病的发展进程可能会很快 ， 因此缩短诊断的时间是很重要的 。 大约有4000个基因发生表型突变 ， 其中许多表型的改变在生命的前28天内就出现了 。 对于新生儿重症监护病房的患者 ， 连续的基因检测对于最佳的临床管理来说可能过于缓慢 。 此外 ， 考虑到怀疑疾病处于早期阶段 ， 完整的临床表型可能不会在新生儿中表现出来 。 最后 ， 患有急性疾病的新生儿往往在很大程度上存在临床和遗传异质性 ， 这进一步导致了对疑似遗传疾病缺乏及时的分子诊断 。 快速全基因组测序最新技术的发展突出了其在儿童 ， 特别是危重新生儿中的应用 。 一些调查这一人群的研究报告显示 ， 诊断时间范围为5至8天 ， 少至19.5小时 。 在这些研究中 ， 显著提升的速度部分归功于生物信息学的发展 。 针对未诊断的神经发育障碍儿童进行WES和全基因组测序的直接比较 ， Soden等人报道了两种技术之间的显著差异 ， 其中使用快速全基因组测序的诊断时间明显低于WES 。
已经有很多的研究表明基于NGS的技术可以提高诊断率 。 最近的一次系统性回顾将基于NGS的技术（WES及全基因组测序）与CMA在诊断率方面进行了比较 ， 发现前者相对于后者在诊断率方面有显著的提升 。 将全基因组测序和WES的诊断率进行直接比较是比较困难的 ， 因为诊断率会随着一系列的因素而改变（包括病人的选择倾向、临床指症以及持续的致病性变异的发现等）（表1） 。 重要的是 ， 有其他的一些研究表明全基因组测序对于智力低下、神经发育异常、不明原因的发育迟缓、危重新生儿以及早期婴儿癫痫性脑病的孩子相对于其他检测方式（比如传统的遗传学检测手段、WES以及CMA）有更高的诊断率 。 NGS显著加快了对新疾病-基因关系发现的步伐 ， 使得在之后对WES及全基因组测序数据进行重新分析时在一定程度上提高了诊断率 。 这种诊断率的提升在全基因组测序中更显著 ， 因为全基因组测序相对于WES有更好的外显子覆盖度 。 认识到外显子捕获的显著改进可以提升WES对致病性变异的检测很重要 。 然而 ， 也可以在一开始就使用全基因组测序以获得一个全面的数据集 ， 就不需要在这些技术改进中重复使用WES了 。
基因组|基因组测序在患有罕见、未确诊或遗传性疾病的婴幼儿中的应用
文章插图

表1
从最狭义的意义上讲 ， 临床效用是指通过采用以检测结果为条件的有效治疗方法来预防或改善不利的健康结果 ， 如死亡率、发病率或残疾 。 对儿童进行基因诊断是很重要的 ， 因为它可以使得疾病干预在早期和知情情况下进行 ， 在某些情况下甚至可以挽救生命 。 比如 ， 在一个难治性低血压和无尿的早产儿中应用基于NGS的基因panels检测到两个复合杂合缺失 ， 随后对其应用一种改善肾功能的方案进行治疗 ， 这样患者在以后的生活中只有轻微的慢性肾功能衰竭症状 。 同样 ， 通过基因诊断从分子水平对癫痫性发作进行分类能告知哪种抗癫痫治疗会产生最好的结果 ， 有时还能逆转致痫性异常 。 WES的临床应用已经确定 ， 如癫痫脑病患者所证明的 ， 在通过WES诊断后 ， 改变了之前的物理治疗方式 ， 停止了无效的喂养行为 。
越来越多的研究证明了全基因组测序的临床应用 。 例如 ， 在一项小型回顾性研究中 ， 应用快速全基因组测序为危重患儿进行诊断 ， 其中65%展示了诊断的直接的临床实用性 ， 20%展示了诊断后良好的临床管理 ， 30%的人开始了姑息治疗 。 另一项研究调查了一个具有临床异质性的儿科群体 ， 该调查显示 ， 用全基因组测序进行诊断相对于其他的遗传学检测对临床护理有更重大的影响 ， 并且基于公布的诊疗指南、病例报道以及涉及到的基因的已知功能也会对疾病的诊疗管理产生一定的变动 。 同样 ， 在不明原因的神经发育障碍儿童中 ， 全基因组测序诊断后 ， 49%的患者报告了临床护理相关的变化 。 尽管这些研究的规模都不是很大 ， 这些数据都是建立在WES的临床应用基础上的 。 越来越多的研究集中于将全基因组测序作为一线的检测手段 ， 而不是用于可以证明其临床用途的最后一种解决问题的检测方式 。 由于越来越多的全基因组测序研究的出现 ， 全基因组测序相对于WES的临床实用性也越来越明朗 。
一种诊断方式的持续时间与医疗成本密切相关 。 对于那些患有罕见或未确诊遗传性疾病的患者来说 ， 标准诊断流程的费用是很昂贵的 ， 因为当先前的分析不能提供诊断结果时 ， 需要进行额外的检测、进行其他的程序 ， 有些还需要专家会诊 。 例如 ， 美国一项关于患有神经发育障碍的儿童的研究估计 ， 在接受基于NGS的诊断之前进行检测的费用为19100美元 。 因此 ， 基于NGS的全面检测方法比迭代式的单个基因检测更具成本效益 。 最近的一项微成本研究表明 ， 基因组测序途径 ， 即在最初怀疑遗传疾病时进行基因组测序 ， 可以提供一种有效和经济的方法 ， 以实现诊断 ， 节省医疗费用 。 与标准诊断途径相比 ， 在对怀疑患有单基因疾病的儿童诊断过程的早期纳入WES ， 每额外诊断一次 ， 可增加节省6838美元的成本 。 同样地 ， 在一组疑似遗传原因导致的复杂神经系统疾病儿童中 ， WES获得了比标准治疗途径更明确的诊断 ， 且没有更高的费用 。
当前来说全基因组测序的费用高于WES 。 然而 ， 重要的是要记住全基因组测序的优点 ， 也要记住全基因组测序所带来的额外价值 。 在一项针对自闭症儿童的微成本研究中 ， 全基因组测序的预估费用要高于CMA和WES 。 研究指出 ， 与WES相比 ， 全基因组测序的自动化可以同时处理多个样品 ， 从而减少操作的时间 。 作者指出 ， 高成本的全基因组测序主要是由于更大的生物信息学需求 。 生物信息学自动化和解读技术的进步将使全基因组测序的成本更接近WES 。 当比较全基因组测序和WES的成本时 ， 考虑不同技术的成本驱动因素是很重要的：超过90%的全基因组测序成本直接与测序有关；对于WES来说成本主要来源于DNA捕获以及为之相关的努力 。 随着时间的推移 ， 测序成本已经大大降低 ， 因此在特定的疾病群体中诊断过程的早期进行全基因组测序相对于先应用CMA然后在进行WES检测来说会更省钱 。
对于WES和全基因组测序的临床应用存在一系列的伦理问题 。 WES和全基因组测序会频繁地鉴定出意外和次要发现-与进行检测的疾病无关 ， 但是对儿童或家庭具有潜在重要性的基因变异 。 报告偶然发现是有争议的 ， 并有时会导致相互矛盾的政策建议 。 一些人建议报告那些会导致临床上可干预的疾病的致病性变异 ， 而对于那些临床上不可治疗的疾病的致病性变异则不报告 。 有些人则建议报告所有的致病性变异 ， 包括隐性疾病的携带者情况 。
WES和全基因组测序产生的大量变异对其在常规临床实践中的应用造成了很大的挑战 。 商业以及实验室开发的信息分析工具已经发展成过滤了大部分的变异 ， 只留下几百个变异供人工分析 。 但这仍然是一项很耗时的工作 。 当前出现了通过摄取表型信息以生成候选基因列表的信息学工具 。 将过滤变异的工具与提出基因列表的工具结合起来 ， 可以显著减少分析时间 。
本文我们列举了全基因组测序作为一线工具对罕见及未确诊的遗传性疾病进行诊断的证据 。 全基因组测序提高了各种分子病因学疾病的诊断率 ， 并且可以减少确诊所需要的时间 。 接受分子诊断对患者及其家属也有深刻的社会心理影响 ， 因为他们可以明确所患疾病的种类 ， 并将其家人与其他类似的患者联系起来 。 最后 ， 得到明确的诊断后 ， 就可以进行特定疾病的遗传咨询服务 ， 这可能会对生育计划产生影响 ， 在某些情况下 ， 还会影响治疗的方式 。
将全基因组测序作为一线的检测手段 ， 而不是在所有其他遗传学手段检测不出来最后才使用这种方式进行确诊 ， 这对于许多群体来说是很有益的 ， 尤其是那些危重症新生儿 ， 迅速的诊断是必不可少的 。 未来的研究应该探索快速全基因组测序在哪些疾病和临床表现中最有诊断效力 ， 并且最有可能影响急性疾病的临床管理 。 很少有在成年人中使用基于NGS进行检测的相关文献 。 对于患有疑似遗传性疾病的成人患者 ， 寻求相关的确诊面临更多的挑战 ， 因为需要进行额外的考虑 ， 比如老龄化、环境因素等都需要慎重考虑 。
最后 ， 随着生物信息学方法的发展以及对非编码区致病性变异的检测和理解的不断增长 ， 全基因组测序的诊断率也会相应地提升 。 对于患有罕见及未确诊疾病的儿科患者 ， 将全基因组测序作为一线检测手段应用于临床可以提升诊断率、减少确诊的时间 ， 最终对临床护理产生积极的正面影响 。
作者介绍
王小艳 ， 湖北省妇幼保健院检验科遗传室 ， 13年硕士研究生毕业于中南大学医学遗传学国家重点实验室


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