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背景介绍
人体内细胞更新率较高的组织 ， 如造血系统或消化道系统 ， 依赖于各自的成体干细胞进行持续的再生 。 不过 ， 这些细胞可能发生突变并导致癌症 。 肿瘤干细胞（Cancer stem cells ， CSCs）能够促进癌症的发生发展 ， 并构成了复发的重要驱动因素 。 但是 ， 由于肿瘤干细胞具有低分裂率的特征 ， 使其难以作为治疗的靶点 。 因此 ， 迫切需要能够可靠地鉴定肿瘤干细胞的工具和方法 。
急性髓系白血病（AML）是癌症干细胞研究的范式 ， 10%-20%年龄超过70岁的健康个体中 ， 其造血干细胞（HSCs）会获得癌前突变导致少量造血干细胞来源的克隆占主导地位 ， 虽然这种白血病前干细胞 (pre-LSCs) 能够产生健康的血液和免疫细胞 ， 但这些pre-LSCs的存在最终是产生白血病干细胞 (LSCs) 的推动力 。
白血病经典的化疗方案主要针对 “原始细胞（blast cells）”以达到缓解效果 。 不过LSCs由于其保持静息状态 ， 因此往往难以被根除 。 这也导致某些白血病的复发率较高 ， 60岁以上患者的5年生存率低于15% 。 因此 ， 改善治疗的关键是确定靶向LSCs的治疗策略 ， 同时保留健康的造血干细胞 。 而描述造血干细胞、pre-LSCs和LSCs之间的基因表达差异将是实现这一目标的关键一步 。 单细胞基因组学在绘制造血分化模型中具有重要的应用价值 ， 但是根据单细胞转录组数据去识别突变或克隆仍然很困难 。
近日 ， 来自巴塞罗那科学技术学院、欧洲分子生物学实验室等单位的研究人员在Nature Communications在线发表了题为“Identification of leukemic and pre-leukemic stem cells by clonal tracking from single-cell transcriptomics”的文章 ， 报道了一种名为MutaSeq的测序方法和一个名为mitoClone的计算工具 ， 两者结合可以根据线粒体突变实现高度可信的克隆识别和追踪 ， 凭借该技术 ， 研究人员成功区分了AML患者来源的造血干细胞、pre-LSCs、LSCs和造血祖细胞 。 该研究表明可以从单细胞转录组中同时绘制基因组和线粒体突变 ， 并能以此鉴定癌症干细胞及其特征 。
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文章发表在Nature Communications
主要内容
MutaSeq: 一种高质量单细胞RNA-seq数据获取的技术方法
为了在单细胞转录组数据中建立一个高度可信的人类细胞克隆追踪实验方法 ， 研究人员首先评估了高测序深度的单细胞转录组测序方法-Smart-seq2 ， 通过对其流程的修改 ， 他们发现 ， 在逆转录过程中 ， 添加靶向引物往往会导致额外序列的形成 。 不过 ， 当在cDNA扩增过程中瞄准感兴趣的位点时 ， 他们获得了高质量的转录组数据 ， 同时将单个细胞捕获的平均靶点数增加了2-4倍 。
接下来 ， 为了评估MutaSeq ， 研究人员对一名AML患者（P1）进行了深度外显子组测序 ， 并设计了针对14个核突变的引物 ， 然后系统地比较了MutaSeq和非靶向Smartseq2在该患者CD34+细胞上的表现 。 结果表明 ， MutaSeq不仅增加了每个细胞覆盖的靶位点的数量 ， 而且还拥有更高的精度 。 重要的是 ， 与其它单细胞转录组测序方法相比 ， 这两种方法对线粒体基因组均有较深的覆盖 。
以上结果表明 ， 在单细胞转录组测序实验中 ， MutaSeq有效地覆盖了线粒体基因组 ， 并且与Smart-seq2相比 ， MutaSeq提供了更好的基因组靶位点的覆盖 。 重要的是 ， 除了在cDNA扩增过程中添加靶向引物外 ， 它不需要改变现有的Smart-seq2的流程 。
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图1. MutaSeq原理及其性能检测 ， 图片来源：Nature Communications
线粒体和基因组突变的结合能够优化克隆层级聚类
为了研究MutaSeq是否能够区分白血病、白血病前和残留的健康克隆 ， 研究人员从4名基因型和表型存在异质性的AML患者中获取了单细胞转录组数据 ， 并基于此去鉴定核基因组突变以及线粒体突变 ， 以便探索线粒体突变是否可以与核内基因组突变一起用于改进克隆层级聚类 。
结果表明 ， 与基因组突变不同 ， 来自线粒体突变的克隆鉴定大多不受基因表达水平或文库质量的影响 ， 并且线粒体基因处于高表达水平 ， 因此基于较低的测序深度就可鉴定 。 更重要的是 ， 这些基于线粒体突变鉴定的克隆结构随后也被靶向单细胞基因组测序所验证 。 因此 ， 上述方法能够鉴定白血病、前白血病和健康的克隆 ， 并且如果存在线粒体体细胞变异 ， 可以更加准确地将单个细胞分配给相应克隆 。
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图2. 线粒体突变是AML中高度可信的克隆标记 ， 图片来源：Nature Communications
克隆追踪识别与白血病前和白血病突变相关的细胞分化状态和基因表达模式
接下来 ， 为了确定单个细胞的状态 ， 研究人员整合了单细胞基因表达数据和克隆追踪结果 。 分析结果表明 ， 仅使用单细胞基因表达的数据 ， 无法区分健康的造血干细胞和癌症干细胞 ， 但是结合克隆追踪的突变数据 ， 就能够高度可信地为细胞分配克隆身份 ， 进而进行定量分析 。 白血病突变相关的克隆在造血干祖细胞中最普遍 ， 但在淋巴谱系的细胞 (B、NK、T)中几乎不存在 。 相比之下 ， 而白血病前突变相关的克隆在所有谱系中均被发现 ， 但大多数在淋巴系中的含量较低 ， 这些结果强调了白血病突变可能在不同谱系上启动分化阻滞 。
在此基础上 ， 研究人员也详细研究了不同突变的分子效应 ， 系统比较了仅有单个突变差异的克隆之间的基因表达 ， 从而阐明该突变对人类造血的特定影响 ， 此外也比较了所有pre-LSCs和非白血病细胞之间的基因表达 ， 以识别所有pre-LSCs中存在的潜在标记物或药物靶点等 。
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图3. 细胞状态识别及前白血病突变对细胞分化的影响 ， 图片来源：Nature Communications
研究总结
综上所述 ， 该研究报道了一种联合单细胞转录组学和克隆追踪的方法（MutaSeq和mitoClone） ， 并在急性髓系白血病的背景下验证了该方法 。 研究结果表明 ， 该方法可以用来分析LSCs的分化能力 ， 并绘制致癌突变的克隆层级 ， 同时 ， 基于基因组和线粒体突变的克隆追踪 ， 能够清晰地区分健康克隆和癌变克隆 。
【单细胞转录组|Nature子刊｜新型单细胞转录组测序方法可实现肿瘤克隆鉴定及追踪】在此基础上 ， 对LSCs、HSCs、pre-LSCs、健康的造血祖细胞和原始细胞进行区分 ， 以鉴定LSCs特异性基因表达模式 ， 并对白血病突变诱导的分化进行探索 。 该研究证明了单细胞多组学方法在表征癌症干细胞方面的能力 ， 同时该研究提出的方法亦可以应用于其它类型的癌症研究中 。
参考文献
1. Velten, L., Story, B.A., Hernández-Malmierca, P. et al. Identification of leukemic and pre-leukemic stem cells by clonal tracking from single-cell transcriptomics. Nat Commun 12, 1366 (2021).
2. Clevers, H. What is an adult stem cell? Science 350, 1319–1320 (2015).
Meacham, C. E. & Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature 501, 328–337 (2013).
3. Greaves, M. Leukaemia ‘firsts’ in cancer research and treatment. Nat. Rev. Cancer 16, 163–172 (2016).
4. Bowman, R. L., Busque, L. & Levine, R. L. Clonal hematopoiesis and evolution to hematopoietic malignancies. Cell Stem Cell 22, 157–170 (2018).
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