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改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？( 五 )


Cas9酶究竟如何在RNA的指导下切割DNA？
这些结果令我倍感振奋 ， 但与此同时 ， 这也引出了一系列亟待解决的问题 。 为了理解Cas9酶究竟如何在RNA的指导下切割DNA ， 我们需要精确定位Cas9蛋白质中执行切割功能的区域 。 为了证明DNA切割的专一性 ， 以及切割依赖于向导RNA与DNA序列的匹配 ， 我们需要逐个碱基地改变DNA序列 ， 并表明当RNA-DNA匹配不够完美的时候 ， 切割就无法进行 。 要表明向导RNA和tracrRNA是如何工作的 ， 我们需要对这两种分子进行系统的缺失突变 ， 找出真正必需的RNA片段 。
为了回答这些问题 ， 马丁和克日什托夫进行了辛苦的工作 ， 但很快 ， 一个清晰的画面逐渐浮现出来 。 他们发现 ， Cas9蛋白质会锚定在DNA双螺旋上 ， 撬开DNA双链 ， 使CRISPR的RNA分子与DNA的一条链形成新的双螺旋 ， 然后 ， Cas9蛋白质使用两个核酸切割模块把DNA的双链同时切开 ， 制造出双链断裂 。
事实上 ， Cas9可以锁定并切割任何与向导RNA配对的DNA序列 。 打个比方 ， 向导RNA的功能就像GPS可以指导Cas9精确定位到目标区域 ， 即向导RNA和DNA配对的位置 。 Cas9是一个真正可以操作的核酸酶 ， 我们可以定制设计该RNA分子 ， 使它靶向锁定任何DNA序列 。 有了包含20个碱基的向导RNA ， Cas9可以找到任何与其配对的DNA ， 并进行切割 。
考虑到细菌与病毒在演化过程中鏖战不休 ， Cas9的功能不难理解 。 配备了从CRISPR序列中转录出的RNA分子 ， Cas9可以在噬菌体基因组中轻易地找到与之对应的DNA区域 。 这是细菌的巡航导弹?针对病毒的DNA精确快速地实施打击 。
有了马丁和克日什托夫的实验结果 ， 我们就可以着手解决下一个问题了：如果细菌可以用Cas9蛋白质来切割特定的病毒DNA序列 ， 那么 ， 我们是否可以用Cas9切割其他DNA序列 ， 而不局限于噬菌体？
马丁和我清楚基因编辑领域的进展以及它的潜力 ， 我们也知道锌指核酸酶和TALEN的核酸酶的致命缺点 。 我们不无惊叹地意识到 ， 我们已经误打误撞发现了一个新系统 ， 它有望超越现有的基因编辑技术 。 要把这个微小的分子机器变成强大的基因编辑工具 ， 我们还需要更进一步的实验 。
目前为止 ， 我们把一个复杂的免疫系统还原成了几个可以分离、修饰并重新组合起来的元件 。 此外 ， 通过精细的生化试验 ， 我们理解了这些元件的功能 ， 并推断出了其分子机理 。 下一步 ， 我们要做的是 ， 确认可以改装Cas9和向导RNA分子来靶向锁定并切割任何DNA序列 。 这个实验会真正展示出CRISPR的全部威力 。 这一步?改造CRISPR-Cas9分子机器?事实上包括了两小步：产生一个想法 ， 再用实验验证它 。
首先是要有想法 。 马丁向来一丝不苟 ， 为了鉴定每一个碱基对功能的影响 ， 他系统地修饰了RNA分子?包括用于靶向锁定DNA的向导RNA分子 ， 以及把它和Cas9结合在一起的tracrRNA分子 。 有了这些知识 ， 马丁和我进行头脑风暴 ， 考虑如何把这两种分子组合到一起 。 如果我们可以把一个分子的尾巴跟另一个的头部融合起来 ， 制造出杂合的RNA ， 如果可行 ， 那会大大简化该分子机器 ， 两条RNA分子?向导分子（CRISPRRNA）和协助分子（tracrRNA）?将合二为一 。 显然 ， 如果CRISPR要用于基因编辑 ， 简化的系统用途会更广 。
基于这个想法 ， 我们设计了实验 。 我们需要测试这个融合的RNA分子 ， 并鉴定它是否依然可以指导Cas9切割对应的DNA序列 。 此外 ， 我们的实验还可以回答Cas9蛋白质是否真的可以切割任何DNA序列 ， 而不只是针对噬菌体的基因片段 。 这时 ， 我们意识到了这是一个重大突破 ， 为了尽快完成实验 ， 我们并不想浪费时间寻找那些实验室没有的基因 。
于是 ， 出于方便 ， 而不是偏好 ， 我们决定使用一个来自水母的编码绿色荧光蛋白质的基因 ， 即GFP（GFP广泛应用于世界各地的实验室 ， 用于示踪细胞及其蛋白质成分） 。 马丁在GFP基因里选取了长度为20个碱基的5段区域 ， 并针对性地设计了5种配对的RNA分子 。 准备好了新的单链RNA分子之后 ， 我们就把它们与Cas9蛋白质以及GFP基因放在同样的DNA切割反应?现在 ， 这个酶促反应已经成了常规实验 。


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