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改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？( 四 )


改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？
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Cas9使用两个RNA分子切割DNA 。
迈克在我们实验室的工作马上就要结束了?他马上要返回德国 ， 完成博士论文 ， 而且已经订好了机票 ， 但是 ， 迈克和马丁下决心测试纯化的Cas9酶是否可以切割DNA 。 他们参照埃马纽埃尔在化脓链球菌中的工作 ， 合成出了CRISPR的RNA分子 。 然后 ， 他们把这些RNA分子与Cas9蛋白质和一些DNA样品混合起来 。 重要的是 ， 这些DNA样品中有一段序列跟这些RNA配对 。
像大多数科学探索一样 ， 这次实验以失败告终 。 在接触Cas9蛋白质和配对的向导RNA前后 ， DNA没有任何变化 。 要么迈克的实验设计不合适 ， 要么Cas9的确没有切割DNA的功能 。 迈克在实验室组会展示了他的结果 ， 悻悻地返回德国了 。 这个夏天辛勤的分离、纯化、研究Cas9的工作似乎是竹篮打水一场空 。
在我们跟埃马纽埃尔、克日什托夫的合作进展过程中 ， 马丁开始跟迈克密切合作 ， 并指导他的实验 ， 但马丁也开始寻找教职 。 面试的时候 ， 他的足迹也遍及世界各地 ， 包括瑞士 ， 他最终接受了苏黎世大学的工作邀请 。 不过 ， 对我们来说 ， 幸运的是 ， 在迈克离开的时候 ， 马丁的日程安排稍微不那么紧张了 ， 因此他可以从迈克遗留的问题入手 ， 接手这个课题 。 他把注意力转向了Cas9 ， 打算解决这个遗留问题：Cas9的功能到底是什么？
迈克和马丁的工作似乎表明了Cas9不能切割DNA ， 但是 ， 实验本身是否可能有问题呢？这有许多可能 ， 从最无趣的（比如 ， 试管里的蛋白质降解了）到有趣的（比如 ， 我们缺少了该反应必需的一个成分） 。 为了探索后一种可能 ， 马丁和克日什托夫开始尝试不同的办法来设计检测DNA切割的实验 。 真是无巧不成书 ， 他们很快发现 ， 他俩长大的地方非常接近?克日什托夫在波兰境内 ， 而马丁在当时的捷克斯洛伐克境内 ， 他们都说波兰语 ， 这极大地方便了他们通过Skype交流 ， 商讨实验 。
最终 ， 克日什托夫和马丁进行的实验表明 ， 除了向导RNA ， 他们还需要第二种RNA ， 叫作tracrRNA ， 埃马纽埃尔实验室发现 ， 在化脓链球菌中 ， tracrRNA对于向导RNA合成是必需的 。 结果很简单 ， 但我们却非常兴奋：与向导RNA分子里20个碱基完全匹配的DNA被干净地切开了 。 对照实验表明 ， 这种匹配对于切割是必需的 ， 如同Cas9蛋白质和tracrRNA同样是必需的 。
本质上 ， 这些结果以最少的成分模拟了CRISPR免疫反应在细胞内的进程?Cas9和两个RNA分子代表了细胞内的分子 ， 而DNA分子代表了噬菌体的基因组 。 最重要的是 ， 基因组里有20个DNA碱基与向导RNA分子配对 ， 这意味着 ， 向导RNA与DNA的一条链可以通过碱基配对形成双螺旋 。 这样的DNA-RNA双螺旋可能是Cas9特异性切割DNA的关键之处 。
我们无法直接看到DNA被切割 ， 所以需要一种灵敏的检测方法监控试管内的DNA切割反应 。 一段含有50个碱基对的DNA双螺旋长约17纳米 ， 大致相当于最细的头发丝直径的千分之一 。 即使是用最强大的显微镜也无法看到它 ， 因此 ， 马丁和克日什托夫采用了核酸研究人员最爱的两种工具：放射性同位素磷和凝胶电泳分析 。 放射性磷原子可以通过化学反应与DNA分子结合 ， 使DNA在感光胶片上显影 ， 由于DNA带有负电 ， 它在电场中会向正极运动 ， 凝胶中的空隙则起到了筛子的作用 ， 使得DNA可以根据大小在凝胶电泳中得到区分 。
如果DNA被Cas9蛋白质切开 ， 那么我们就可以看到两条带 ， 否则就只有一条带 。 马丁进一步表明 ， Cas9蛋白质在向导RNA与DNA匹配的位置把DNA的双链都切开了 。 重要的是 ， 向导RNA和tracrRNA分子在切割完DNA之后并未发生变化 ， 因此可以被Cas9重复使用 。 看到这些结果 ， 我们意识到 ， 我们澄清了这个DNA切割机器的几个关键环节 ， 包括化脓链球菌和嗜热链球菌（以及其他含有类似CRISPR系统的细菌）中靶向识别噬菌体序列 ， 进而摧毁噬菌体DNA的分子机制 。 DNA切割的三个关键成分是Cas9酶、向导RNA和tracrRNA 。


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