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改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？( 三 )


我们不能忽视了基因编辑给我们——特别是对遗传病患者——提供的无比珍贵的医疗机遇 。 试想 ， 假如有人知道了他/她携带着一份突变版本的HTT基因（这意味着他/她肯定会患上早发性失智症） ， 如果他/她能够提前获得基于CRISPR的治疗 ， 在症状发作之前就剔除突变的DNA ， 这会免去多少痛苦——而这种治疗手段在以前是无法想象的 。 因此 ， 虽然我们还在辩论是否应当对生殖细胞进行基因编辑 ， 但我们也很小心地避免让公众对CRISPR产生敌意 ， 甚至反对基因编辑技术的临床应用 。
Cas9的功能究竟是什么？
Csn1蛋白质的名字几经演变 ， 最终 ， 在2011年夏天 ， 确定为Cas9 。 在我追踪Cas9相关研究的时候 ， 虽然它变来变去的名字带来了一些麻烦 ， 但是我从未怀疑过它的重要性 。 罗多尔·巴兰高和菲利普·霍瓦特在2007年的研究表明 ， 如果使cas9基因失活 ， 嗜热链球菌抵抗病毒入侵的能力会下降 。 此外 ， 约西亚娜·加诺和席尔万·莫伊诺发现噬菌体基因组在CRISPR免疫反应过程中被切开之后 ， 又进一步表明 ， 如果使cas9基因失活 ， CRISPR就不会摧毁病毒的DNA 。
与之类似 ， 在埃马纽埃尔（埃马纽埃尔·卡彭蒂耶 ， Emmanuelle Charpentier）使用化脓链球菌的实验中 ， cas9基因失活会导致CRISPR转录出的RNA分子残缺 ， 并降低整体的免疫水平 。 最终 ， 在2011年秋季 ， 由维尔日尼胡斯·塞尼相克斯实验室和丹尼斯克公司的罗多尔·巴兰高、菲利普·霍瓦特共同完成的研究显示 ， cas9基因是嗜热链球菌中对于抗病毒反应的一个必需的cas基因 。
改写生命密码：诺奖所说的“基因剪刀”究竟是什么？
本文插图
CRISPR的RNA分子与Cas蛋白质靶向锁定病毒DNA 。
随着我对Cas9的了解越来越多 ， 我也越来越意识到Cas9在II类CRISPR免疫反应的DNA摧毁阶段可能扮演了关键角色 。 起码 ， 在链球菌属里 ， 它是一个必需基因 ， 但是我们有理由认为 ， II类系统中的每一个关键成分在其他系统里都同样重要 。 不过 ， Cas9的功能究竟是什么 ， 我们仍然不清楚 。
马丁（捷克博士后科学家马丁·耶奈克 ， Martin Jinek）、我和埃马纽埃尔 ， 进行了一次Skype网络电话会议 ， 开始商议Cas9实验要采取的策略 。 安排这次会议颇费周章：埃马纽埃尔当时在瑞典北部的于奥默大学（Ume? University） ， 比美国太平洋时间早了10个小时 ， 而她实验室里领衔CRISPR课题的是克日什托夫·切林斯基（Krzysztof Chylinski） ， 在维也纳大学工作 ， 这是埃马纽埃尔先前的工作机构 。 总之 ， 这是一个相当国际化的合作团队：一位人在瑞典的法国教授 ， 一个在奥地利的波兰学生 ， 一个德国学生 ， 一个捷克博士后 ， 以及一位在伯克利的美国教授 。
我们终于找到了一个适合所有人的时间 ， 然后就开始规划实验蓝图 。 从我们实验室的角度看 ， 最初的目标相当直接：我们需要想办法分析、纯化Cas9蛋白质 ， 这是埃马纽埃尔的实验室无法做到的 。 有了Cas9在手 ， 我们就可以着手进行生化试验 ， 鉴定Cas9是否如我们推测的那样与CRISPR的RNA分子相互作用 ， 以及它在抗病毒免疫反应中发挥了什么功能 。
埃马纽埃尔的博士学生克日什托夫给我们寄来了一个质粒 ， 其中包含了化脓链球菌的cas9基因 ， 然后迈克在马丁的细心帮助下开始蛋白质纯化的工作 。 首先 ， 迈克把重组的DNA引入了不同类型的大肠杆菌 ， 他系统地测试了几十种不同的条件 ， 来优化Cas9蛋白质表达 ， 这就像园丁筛选不同的土壤和肥料组合 ， 以找出适合新花卉的最优生长条件 。 其次 ， 迈克测试了纯化出的Cas9蛋白质的稳定性 。
有些蛋白质非常娇贵 ， 使用一次之后就“变质”了 ， 往往是因为蛋白质凝聚或者沉淀 ， 会导致试管中的蛋白质溶液变成奶白色；另外一些蛋白质则可以反复冻融 ， 状态依然稳定 。 我们很幸运?Cas9蛋白质很稳定 。 最后 ， 进行生化实验的时间终于到了 。 在迈克和马丁纯化、分离Cas9蛋白质的过程中 ， 我们就猜想 ， 这个蛋白质如果具有切割DNA的功能 ， 这可能要依赖于向导RNA 。 在我们研究过的I类CRISPR系统中 ， 向导RNA与多个Cas蛋白质结合 ， 形成识别和切割DNA的分子复合体 。 我们设想 ， Cas9的工作方式可能与此类似 。 事实上 ， 氨基酸序列分析表明 ， Cas9蛋白质里可能有两个独立的核酸切割模块 ， 其中至少有一个会切割噬菌体的DNA 。


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