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层析柱保留时间怎么计算，层析柱床体积的概念怎么理解( 三 )

生活经验层析



Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义多肽作为配基，这种多肽是由反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如 ， Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到 。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法 。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的 。
3、 毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)――分离分析方法：

CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍 。此技术从80年代以来发展迅速 ， 是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具 。CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳(Capillary Zone electrophoresis，CZE)、毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoeletric Focusing，CIEF)、毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis ， CGE)和胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography，MECC)等 。
1)  毛细管区带电泳(Capillary Zone electrophoresis，CZE)

CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电荷不同 ， 且分离效果只由带电性决定，比传统凝胶电泳更准确 。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛吸管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间 ， 针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如，调节电泳液的pH值 ， 使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的CZE柱来分离 。Issaq等利用CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件 ， 即在低pH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子，如，Zn2＋等，此时分离速度快而且准确 。
2)  毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoeletric Focusing，CIEF)

由于不同的蛋白、多肽的等电点（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的电泳槽中 ， 其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽分离开来 。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多 ， 主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离 ， 如对rHG不同异构体分离 。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用 。
3)  毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)

CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离 。目前，又有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽类物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离 。这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定 。
4)  胶束电动毛细管层析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography，MECC)

MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如，SDS ， 使一些中性分子带相同电荷分子得以分离 。特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果 。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得到分离 。
4、 多肽及蛋白质分离工程的系统应用

以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合，根据分离多肽性质的不同 ， 采用不同的分离手段 。特别是在后基因组时代，对于蛋白质组深入的研究 ， 人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进，综合利用了蛋白质和多肽的各种性质，采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法，同时利用了高效液相色谱 ， 毛细管电泳，2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽 。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术是实现蛋白质组计划的关键 。其中电泳技术在此项研究中即是分离手段也是分析方法之一 。特别是以下提到的质谱技术的发展，大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率 。
分析方法

1、 质谱分析(Mass Spectrometry，MS)

MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用，特别是在分离纯化后的在线分析中，MS的高灵敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定 。其中连续流快原子轰击质谱(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment，cf-FAB)和电雾离子化质谱(Electrospray Ionization，EIS)是近几年发展起来的新方法 。


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