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层析柱保留时间怎么计算，层析柱床体积的概念怎么理解( 二 )

生活经验层析


2)  疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography ， HIC)

HIC是利用多肽中含有疏水基团，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-HPLC具有较少使多肽变性的特点 。利用HIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比RP-HPLC分离的要稳定，活性较稳定 。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ，通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品 。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了 ， 均具有良好的生物活性 。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化 。而RP-HPLC则不能达到这一要求 。
3)  分子排阻色谱(Size-Exclusion chromatography，SEC)

SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便 。如人重组生长激素（hGH)的分离 ， 不同结构、构型的GH在SEC柱上的分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体 。利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEG具有半衰期长、作用强的特点 。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析 。
4)  离子交换色谱(Iron-Exchange chromatography，IEXC)

IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽 。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂 ， 如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等 。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多 ， 不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大 。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究 。
5)  膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein，CMP)

CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如，SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白 ， 并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化 。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端） ， 与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关 。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换 ， 从而达到分级分离的目的 。
6)  高效置换色谱(High-Performance Displacement Chromatography，HPDC)

HPDC是利用小分子的高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离目的 。它具有分离组分含量较少成分的特性 。利用HPDC鉴定分离了低于总量1％组分的活性人重组生长激素(rHG) 。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡聚糖(Detran Sulfate，DS)是对β-乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜 。研究表明置换剂的相对分子质量越低 ， 越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来 。
7)  灌注层析(Perfusion Chromatography，PC)

PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果 。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性 。目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用 。
2、 亲和层析(Affinity Chromatography，AC)

AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲合性而分离物质的层析方法 。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如，抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等 。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基有天然的，也有根据其结构人工合成的 。Patel等人利用一系列亲合柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽 。

固定金属亲和层析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)是近年来发展起来的一种亲和方法 。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如，Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好 。其中胰岛素样生长因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、二氢叶酸还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品 。


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