蛋白质浓度测定常用的三种方法蛋白质检测方法 _小知识

蛋白质检测办法（蛋白质浓度测定常用的三种办法）测定蛋白质浓度的办法有很多，科研工作者普遍应用的办法比如紫外接收法，双缩脲法，BCA办法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等，今天小编以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种办法的测定蛋白质浓度的原理、优缺陷、操作以及注意事项做详细介绍。

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【蛋白质浓度测定常用的三种方法蛋白质检测方法】 蛋白质检测办法（蛋白质浓度测定常用的三种办法）
UV法
这种办法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算办法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定进程非常简略，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得成果很不稳固。蛋白质直接定量办法，合适测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简略；但是容易受到平行物资的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，请求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）准确盘算通过盘算OD280/OD260的比值，然后查表得到校订因子F，再通过如下公式盘算最终成果：
蛋白质浓度(mg/资源网ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d为测定OD值比色杯的厚度
D为溶液的稀释倍数

BCA法
原理BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混杂一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质联合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由本来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光接收强度与蛋白质浓度成正比。
BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）供给一个简略，快捷，兼容去污剂的办法，精确定量总蛋白。
成分试剂 A100 mL试剂 B2 mL尺度蛋白（BSA）1 mL2，1 mg/mL
保留条件运输温度：室温（尺度蛋白 4～8 ℃ 运输）
保留温度：室温（尺度蛋白 -20 ℃ 保留）
有效日期：12 个月
应用办法

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办法一：96 孔板1. 配制 BCA 工作液：依据尺度品和样品数目，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充足混匀。
2. 将蛋白尺度品按 0 L，1 L，2 L，4 L，6 L，8 L，10 L 参加 96 孔板的蛋白尺度品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 L 。取 10 L 待测样品参加 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。
3. 向待测样品孔和蛋白尺度品孔中各参加 200 L BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。
4. 37 ℃ 温浴 30 min 。冷却至室温。
5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。
6. 制造尺度曲线。从尺度曲线中求出样品浓度。
蛋白质浓度测定常用的三种办法（详解）
办法二：试管法
1. 配制工作液：依据尺度品和样品数目，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充足混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色系统所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，系统须要放大到试验将采取的比色杯精确读数所须要的体积。
2. BSA 尺度品和样品的预备：样品用水或其它不干扰显色反响的缓冲液配制，使待测定的浓度位于尺度曲线的线性部分。每个反响预备 3 个平行测定。尺度曲线一般 5~6 个点即可。依据样品的估测浓度肯定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 g/mL，可按下表的顺序参加 BSA 尺度品、样品及 BCA 工作液。
3. 取适量体积的尺度蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min 。冷却至室温。
4. 将样品与尺度品在 562 nm 波长下测定吸光度。
蛋白质浓度测定常用的三种办法（详解）
考马斯亮蓝法
试验原理考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是应用蛋白质―染料联合的原理，定量测定微量蛋白浓度迅速、敏锐的办法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种办法的突出长处，因而正在得到普遍的运用。目前，这一办法是也敏锐度最高的蛋白质测定法之一。
考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质联合，使染料的最大接收峰 (lmax) 的地位，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的色彩也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光接收的增长量可知与其联合蛋白质的量。研讨发明，染料重要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特殊是精氨酸) 和芬芳族氨基酸残基相联合。