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蛋白质浓度测定常用的三种方法 蛋白质检测方法( 二 )


突出长处（1）敏锐度高，据估量比 Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1 mg 。这是因为蛋白质与染料联合后发生的色彩变更很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光接收值随蛋白质浓度的变更比 Lowry 法要大的多 。
（2）测定迅速、简便，只需加一种试剂 。完成一个样品的测定，只须要 5 分钟左右 。由于染料与蛋白质联合的进程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜资源网色可以在 1 小时内坚持稳固，且在 5 分钟至 20 分钟之间，色彩的稳固性最好 。因而完整不用像 Lowry 法那样费时和须要严厉地掌握时光 。
（3）干扰物资少 。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法 。
缺陷（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芬芳族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制造尺度曲线时通常选用 g-球蛋白为尺度蛋白质，以减少这方面的偏差 。
（2）仍有一些物资干扰此法的测定，重要的干扰物资有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等 。
试剂与器材1、试剂考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，参加 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL 。
2、尺度和待测蛋白质溶液（1）尺度蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，依据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液 。
（2）待测蛋白质溶液 。人血清，应用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍 。
3、器材试管 1.515 cm（6），试管架，移液管管 0.5 mL（2）;1 mL（2）;5 mL（1）；恒温水浴；分光光度计 。
操作办法一、制造尺度曲线取 7 支试管，按下表平行操作 。
摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对比，在 595 nm 处比色 。
绘制尺度曲线：以 A595 nm 为纵坐标，尺度蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制尺度曲线 。
 
二、未知样品蛋白质浓度测定测定办法同上，取适合的未知样品体积，使其测定值在尺度曲线的直线规模内 。依据所测定的 A595 nm 值，在尺度曲线上查出其相当于尺度蛋白的量，从而盘算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL） 。
注意事项（1）在试剂参加后的 5-20 min 内测定光接收，因为在这段时光内色彩是最稳固的 。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗清洁 。
（3）应用考马斯亮蓝法剖析蛋白必需要控制好分光光度计的准确应用，反复测定吸光度时，比色杯必定要冲刷清洁，制造蛋白尺度曲线的时候，蛋白尺度品最好是资源网从低浓度到高浓度测定，防止误差 。
 


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