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多肽固相合成技术 多肽的固相合成


多肽固相合成技术 多肽的固相合成

文章插图
多肽的固相合成(多肽的固相合成技术)
1.固相合成多肽的聚合物载体需要固相载体和连接分子来连接固相和反应物 。载体和连接分子的正确选择决定了固相合成法的成功 。固相合成肽所用的载体多为聚苯乙烯、二乙烯苯等聚合物的衍生物和苯乙烯共聚物，如氯树脂、Pam树脂、王树脂、氨基树脂等 。载体树脂的溶胀状态对缩合反应相关因素有明显影响，如缩合试剂和羧基组分的自由扩散、肽链间的聚集等 。为了使载体具有良好的溶胀性能，并具有足以容纳不断增长的长肽链的大网络空，便于反应物进入载体，一般采用交联度为1% ~ 2%的聚苯乙烯珠树脂或微孔树脂 。
2.连接分子固相合成肽使用了结合不同连接分子的聚合物，这些连接分子是含有氯甲基、巯基甲基、酰氯、对苯甲酰基、芳基磺酰氯、烯丙醇、琥珀酰基、邻硝基苯甲醇和二苯基氯硅烷等的双官能化合物 。一个理想的连接子分子在整个合成过程中必须非常稳定，并且在合成后可以定量削减，而不会破坏合成的目标分子 。合适的接头分子的选择也应该基于与树脂连接的肽的C-末端的结构类型，并且相应的衍生物如羧酸、酰胺或氨基醇可以在切割后产生 。
固相合成肽的检测
即使是高效的偶联技术，也不能保证酰化反应100% 。而且当遇到空间位阻或两层序列时，偶联反应的效率会大大降低 。聚合物载体上总有缺失或截短的多肽链，它们也在解离过程中进入产物，给分离带来很大困难 。所以固相合成肽时，每个氨基酸的缩合率都要达到99.9%，尤其是肽比较长的时候，否则产品会很不纯 。因此，监测每一步反应的进展尤为重要 。(杭州特产肽生物有20多年的固相合成经验，可以满足大部分客户的需求)
1定性显色反应茚三酮显色法(Kaiser method)是利用茚三酮显色反应快速确定树脂上的氨基，从而判断酰化反应是否完全 。茚三酮法检测聚苯乙烯树脂中氨基的灵敏度可达5 mol/g，以此灵敏度可检测缩合反应是否超过99% 。检测茚三酮时，由于末端氨基酸残基和序列不同，颜色强度也不同 。天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)会产生淡蓝色或浅棕色 。显色剂2，4，62三硝基苯磺酸与树脂上的氨基反应，信息资源网显示橙红色，灵敏度为5mol/g树脂 。
Kaiser试剂包括:
茚三酮的6%乙醇溶液
b，乙醇中80%苯酚
c、2%0.001MKCN的2%吡啶溶液
制备好的吡啶需要用茚三酮处理，然后重新蒸熟再使用 。检测过程中，取少量树脂，加入2-3滴A、B、C，100℃加热1-2分钟 。如果溶液为蓝色，或者树脂为蓝色或红棕色，则表明有游离氨基，否则连接完成 。检测游离氨基还有其他方法:三硝基苯磺酸法、苦味酸法、溴芬法等 。
定量游离氨基检测水杨醛法测定肽接枝后树脂上残留的氨基和脱保护基后的总氨基，可以定量检测缩合信息资源网络反应和脱保护基反应是否完全 。如果不完整，可以及时反复处理 。用2%水杨醛+6%吡啶乙醇溶液与树脂上的氨基反应(60℃，30 ~ 35分钟) 。清洗后，用5%苄胺乙醇溶液(60℃，30分钟)代替水杨醛 。用苄胺乙醇溶液稀释后，读取315nm的光吸收值，并计算氨基的量(= 4.36±11) 。对于-—NH2高于0.15mol/mg树脂的样品，该方法的相对偏差在5%以内 。
3多肽合成中途部分保护的中间肽的HPLC检测，取少量肽树脂(3 ~ 10 mg)进行裂解，用乙醚沉淀，溶于适当溶剂中直接进行HPLC分析 。在切割过程中，肽的N-末端保护基团根据需要保留或去除 。当合成信息资源联网的肽是短极性肽时，可以保留保护基，否则在HPLC中保留时间太短，不利于分析 。这种方法虽然麻烦，但耗时短，准确率高 。
反应溶剂
二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是多肽固相合成中常用的溶剂，尤其是DMF因其对反应物和产物的高溶解度而广泛应用于各种反应体系中 。DMF虽然溶解度较好，但沸点较高，需要减压才能蒸馏掉 。此外，副产物N-酰基脲在高介电常数的溶剂(DMF、氨基氰(CH3CN)、二甲基亚砜(DMSO)、H2O等)中容易生成 。)，但在低介电常数的溶剂(CH2Cl2、CCl4、C6H6等)中不易生成 。).在非极性溶剂中，N-保护的氨基酸可以与DCC快速反应形成对称的酸酐 。所以只要能溶解反应物，就尽量使用介电常数低的溶剂 。在固相合成中，DCM多用作溶剂，它有两个优点:比DMF消旋率小，N-酰基脲生成慢 。当羧基成分不易溶解时，可以加入几滴重蒸馏的DMF帮助溶解 。
缩合试剂主要有碳化二亚胺型和鎓盐型(脲鎓) 。


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