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@iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门

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对于许多严重的疾病 ， 例如心力衰竭、晚期糖尿病、血友病、骨髓瘤、末期肝硬化等 ， 目前还未能研发出完全治愈这些疾病的药物 ， 最有效的方法是异体移植 。但是由于供体有限以及自体免疫排斥反应的风险 ， 科学家们苦心专研 ， 尝试寻找除异体移植外 ， 更高效、安全的治疗方法 。诱导型多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)可以来源于受体本身的体细胞 ， 排除了免疫排斥反应的风险 ， 且具有不断自我更新和多向分化潜能 ， iPS细胞来源的心肌细胞、肝细胞、神经细胞、T细胞、造血干细胞和胰岛细胞的移植治疗能够有效解决许多医学难题 。通过CRISPR/Cas9的方法 ， 将模拟疾病发生的突变引入iPSC ， 或修复iPSC疾病模型中的突变, 再分化得到所需要的细胞进行研究或治疗 ， 是目前iPSC研究的大热门 。
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iPSC的CRISPR基因编辑 ， 为各类疾病研究打开新大门
由于iPSC不像普通肿瘤细胞系那样具有总染色体异常和异常强烈的DNA损伤反应的特点 ， 基因编辑在人类iPSC中成功率更低 。但是由于CRISPR/Cas9具有效率高、易于构建和在人细胞中的毒性较低等优点 ， 在iPSC基因编辑中备受青睐 。
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CRISPR/Cas9敲除iPSC中RAG2基因 ， 有效生成具有稳定抗原特异性的CD8αβ-T细胞
T细胞的数量和增殖困难是T细胞免疫治疗的主要障碍 ， 通过使用具有“再生”能力的多能干细胞诱导分化成为具有抗原特异性的T细胞（T-iPSCs）可以克服这一障碍 。严格的抗原特异性对于安全有效的T细胞免疫治疗是必不可少的 ， 然而 ， 人T-iPSC分化的CD8αβ细胞在CD4/CD8双阳性分化过程中 ， 通过T细胞受体（TCR）α链的重排会失去抗原特异性 。通过使用CRISPR/Cas9敲除T-iPSCs中重组酶基因（RAG2）阻止了这种额外的TCR重排 。含有稳定的TCR的CD8αβ-T细胞在异种移植肿瘤模型能有效地抑制肿瘤生长 。这些方法有助于安全有效的T细胞免疫治疗 。
CRISPR-U?可以通过核转染法高效地将gRNA和Cas9转入iPSC细胞中 ， 药筛完成后挑选单克隆培养 。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证 ， 筛选出基因敲除的阳性克隆 。（Minagawa, Atsutaka, et al.）
病人细胞构建iPSC疾病模型 ， 使用CRISPR/Cas9修复引起疾病的点突变位点 ， 深入研究点突变的病理性作用
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease ， AD）是一种进行性和不可逆转的神经退行性疾病 ， 可导致神经细胞变性和脑萎缩 ， 被认为是最常见的痴呆形式 。PSEN1基因A79V突变可引起阿尔茨海默症 ， 通过研究此突变对细胞表型的影响 ， 可帮助研究者深入研究此疾病的病理 ， 从而开发出更有效的治疗方法 。研究者将阿尔茨海默症患者的体细胞诱导为多能干细胞（iPSC） ， 然后通过用野生型序列替换点突变序列 ， 修正突变的基因 。通过研究患者的iPSC和修正后的iPSC ， 可以得知该突变对细胞表型的影响 ， 从而深入研究该突变的病理性作用 。
【@iPSC基因编辑细胞-为各类疾病研究打开新大门】CRISPR-U?可以通过使用核转染法高效地将gRNA载体（含Cas9）和Donor共转入细胞中 ， gRNA和Cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后 ， iPSC细胞以外源携带野生型序列的Donor作为模板进行同源重组修复（HDR） ， 将目标序列重组到基因组点突变的靶位点上 。（Pires, C., et al.）


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