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高效液相色谱基本原理 高效液相色谱分析


高效液相色谱基本原理 高效液相色谱分析

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高效液相色谱分析(高效液相色谱的基本原理)原文丁当学术2020-01-19 20:37:34
文/利剑
全文3470字，建议阅读13分钟 。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，应用范围广，对样品的适用性广 。不受分析对象的挥发性和热稳定性的限制 。几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子化合物和大分子物质都可以用HPLC进行分析测定，从而弥补了气相色谱的不足 。在已知的有机化合物中，大约20%可以用气相色谱分析，而80%需要用高效液相色谱分析 。HPLC具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度好的特点，并且能够分析和分离具有高沸点且不能气化的热不稳定的生理活性物质 。它已成为分离分析技术在化学、医学、工业、农业、商品检验和法律检验等领域的重要应用 。
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基本原理色谱的分离原理是:当溶解在流动相中的各组分通过固定相时，由于与固定相相互作用(吸附、分配、排阻和亲和)的大小和强度不同，在固定相中的保留时间不同，而相继从固定相中流出 。也称为色谱法和色谱法 。
高效液相色谱以经典液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压灌注系统 。流动相如不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂和缓冲液被泵入具有极细颗粒的高效固定相的色谱柱中 。柱内组分分离后，进入检测器进行检测，从而实现对样品的分析 。
图1 。高效液相色谱分析流程
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系统组成HPLC系统一般由输液泵、注射器、色谱柱、检测器、数据记录和处理装置等组成 。输液泵、色谱柱和检测器是关键部件 。此外，还有梯度洗脱装置、在线脱气器、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等 。也可以根据需要进行配置 。现代HPLC仪器还具有微机控制系统，用于仪器自动控制和数据处理 。制备型HPLC仪器还配备有自动馏分收集装置 。
图2 。高效液相色谱仪的系统组成
1.输液系统输液泵是惠普信息资源网LC系统中最重要的组件之一 。输液泵根据输出液体量恒定的因素分为恒压泵和恒流泵 。泵的性能直接影响整个系统的质量和分析结果的可靠性 。
输液泵按工作方式可分为气动泵和机械泵 。机械中有螺杆驱动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复隔膜泵 。
表1 。几种高压性能泵的性能比较
HPLC使用的输液泵应满足以下条件:
①流速稳定，其RSD应小于0.5%，这对定性定量分析的准确性至关重要；
②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应达到100ml/min；；③输出压力高，一般应达到150 ~ 300kg/cm2；
④液压缸体积小；
⑤良好的密封性能和耐腐蚀性能 。
(1)往复式柱塞泵
当活塞向外移动时，泵头出口止回阀关闭，而流动相入口止回阀打开，溶液(流动相)被泵入活塞缸 。当柱塞推入筒内时，入口止回阀关闭，出口止回阀打开，流动相被压出活塞筒，流向色谱柱 。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多 。它的优点是不需要使用阻尼器来消除脉冲，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节比单活塞泵复杂 。往复式柱塞泵的特点是连续供应恒定体积的流动相，不受整个色谱系统其他部分阻力的微小变化的影响 。
图3 。单活塞往复式柱塞泵的结构(a)和双活塞往复式柱塞泵的结构(a)和排液特性(b)
(2)隔膜往复泵
隔膜往复泵也是一种恒流量泵 。当活塞与油接触时，膜片受到油压的作用，吸引或推动流动相部分，使流动相部分的单向阀吸入或排出液体，从而获得稳定的液体流动 。隔膜泵的活塞不与流体直接接触，因此不存在活塞垫圈磨损造成的流动相污染 。隔膜泵死体积小(约0.1mL)，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱 。然而，隔膜泵结构复杂且昂贵 。
4.隔膜往复泵结构示意图
(3)气动放大器泵
气动放大器泵是一种恒压泵 。泵头通常由两部分组成——止回阀和密封圈——柱塞杆 。通常，单向阀由一个阀体\塑料\或陶瓷阀座和一个红宝石球组成 。在压力作用下，红宝石球离开阀座，流动相流经单向阀 。反之，在反向力的作用下，宝石球返回阀座，流动相不再流经止回阀 。
2.脱气装置流动相溶液经常由于溶解氧或与空气体混合而形成气泡 。当气泡进入检测器时，色谱图上会出现尖锐的噪声峰 。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱会使流动相流速变慢或流速不稳定，导致基线波动 。气泡一旦进入色谱柱，需要很长时间才能排出 。在荧光检测中，溶解氧也会淬灭荧光 。溶解的气体也可能导致一些样品氧化或改变溶液的pH值 。


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