■青海省民和县喇家遗址出土汉代马骨的DNA 初步研究( 二 )
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2、样本处理与DNA提取
【■青海省民和县喇家遗址出土汉代马骨的DNA 初步研究】首先取马骨上约1cm×1cm见方的小块 ， 用钻头打磨骨骼表面和截面以去除骨骼表面尘垢 ， 次氯酸钠溶液（有效氯6％）浸泡和紫外照射（紫外灯置于样本以上8cm的高度 ， 波长254nm ， ） ， 用以去除骨骼表面的外源DNA污染 。之后使用冷冻研磨机打磨成粉 。在此基础上采用Yang等提出的硅柱离心法进行DNA提取 。
3、DNA扩增与测序
首先 ， 选择引物L1269/H1346扩增线粒体基因组中12SrRNA基因 ， 对所选样本进行初步种属鉴定 。在此基础上 ， 本文选择了蔡大伟等设计的两对套叠引物来扩增古代家马的线粒体DNA控制区的DNA片段（15473~15772 ， 包括引物长度） ， 优化选择使用Ludwig等已发表的引物来扩增毛色控制基因的核DNA片段 。全部扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测 。PCR阳性产物送到测序公司（Invitrogen）直接测序 ， 正反引物双向测序 。在全部实验过程中 ， 严格按照防污染措施操作 ， 具体实验操作详见 。
4、数据分析
PCR产物所得到的序列使用Chromas Pro软件进行读取 ， 通过ClustalX2软件进行序列比对 ， 并使用BioEdit进行编辑 。使用Network5.0软件构建中介网络图 ， 选择中国考古遗址出土家马（见表四）作为对比序列 ， 详见图一 。
二、结果
1、线粒体DNA序列变异情况及单倍型类群归属
全部8个古代样本都获得了线粒体基因组中12SrRNA基因的部分DNA序列（引物L1269/H1346 ， 去除两端引物后序列长度为77bp） ， 在GenBank数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）对这些DNA序列进行了BLAST共享序列搜索 ， 结果发现这些共享序列全部属于家马 。
其中 ， 有6个古代马骨样本都获得了线粒体DNA控制区的262bp序列（15493~15754 ， 去除两端引物） 。以X79547作为参考序列进行比对 ， 实验结果见表二 。共检测出14个多态性变异位点 ， 全部为转换 ， 没有颠换、插入与缺失 ， 且转换主要在嘌呤之间 ， 占57.1%（8/14） 。另外2个古代马骨样本（EQC224与EQC226）虽然也获得了线粒体DNA控制区的序列 ， 但是多次DNA提取得到的序列结果不能完全匹配 ， 因此本文将这2个样本的实验结果确定为失败 。所获得的6个序列中共检测出5个单倍型 ， 其中EQC229与EQC230共享同一单倍型 。根据Jansen等、McGahern等的关于单倍型类群的划分 ， 基于线粒体DNA序列变异模式 ， 本文的5个单倍型可以归属于单倍型类群A6、D2、D3和F3 ， 详见表二 。
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2、毛色控制基因的SNP位点检测
依据以前研究 ， 本文亦选择常见的和研究相对较深入的6种毛色控制基因的8个SNP位点进行检测 ， 包括MC1R(g.201)、ASIP(g.2183~2193del)、MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)、EDNRB(c.323_333) ， 其野生型为E/E、A/A、C/C、KM0/KM0、sb1/sb1、z/z、z/z、ov/ov 。
本文选择的8个古代马骨样本中 ， 有6个样本获得了全部SNP变异结果 ， 另外2个样本（EQC224与EQC226）获得了部分SNP变异结果 ， 由于这2个样本所得SNP位点结果太少无法对毛色进行推测 ， 因此下文中不再对其进行讨论 。毛色控制基因的SNP位点检测结果详见表三 。在本文检测的6个样本中 ， 有1个样本（EQC227）的基因型与野生型相同 ， 其余5个样本的基因型与野生型不同 ， 但是发生变异的只有MC1R(g.201)和ASIP(g.2183~2193del)两个基因位点 ， 控制的表型分别为栗色（chestnut）和黑色（black） ， 其他基因位点MATP(g.72)、KIT(g.786)、KIT(g.1120)、SILV(g.1457)、SILV(g.697)和EDNRB(c.323_333)未发生变异 。
