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中国七大干细胞库 细胞检测( 二 )


软琼脂克隆形成软琼脂培养通常用于检测肿瘤细胞和转化的细胞系 。当试验琼脂与细胞混合时，琼脂温度不应超过40℃ 。接种细胞密度不超过每平方厘米35个，一般6cm平板接种1000个细胞 。正常细胞在悬液中不能增殖，不适合软琼脂克隆形成试验 。
实验方法:
取对数生长期的XXX细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹成单细胞，计数活细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1106细胞/L 。然后根据实验要求进行梯度倍数稀释 。用蒸馏水分别配制浓度为1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖溶液 。高压灭菌后，保持在40℃不凝固 。将1.2%琼脂糖与2DMEM培养基(含2种抗生素和20%小牛血清)按1:1的比例混合后，取3mL混合液注入直径6cm的平板(10cm平板加7 ~ 10 ml)，冷却凝固后作为底层琼脂，放入CO2培养箱中备用 。将0.7%琼脂糖和2DMEM培养基在无菌试管中按1:1的比例混合后，在试管中加入0.2mL细胞悬液，充分混匀，倒入装有1.2%琼脂糖的底板中，逐一形成双层琼脂层 。上层琼脂凝固后，置于37℃的5% CO2培养箱中10 ~ 14天 。将平板置于倒置显微镜下，观察细胞克隆的数量 。计算形成速率 。
溴脱氧尿苷BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，在复制细胞中可以选择性地整合到新合成的DNA中，代替胸腺嘧啶(细胞周期S期) 。这种掺入可以稳定存在，并随DNA复制进入子细胞 。BrdU特异性抗体可用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力 。
实验方法:
将细胞密度为1.5105个/mL的XXX细胞接种于直径为35 mm的培养皿(内有盖玻片)，培养1天，用0.4%FBS培养基同步培养3天，使大部分细胞处于G0期 。加入BrdU(储备液:1.0毫克/毫升，终浓度:0.03克/毫升)，在37℃孵育40分钟 。丢弃培养液，用PBS清洗载玻片3次 。甲醇/乙酸固定10分钟 。用固定载玻片空气体干燥后，0.3%H2O2-甲醇灭活内源氧化酶30分钟 。5%正常兔血清被阻断 。甲酰胺100℃变性核酸5min 。水浴冰冷后，用PBS洗涤，加入抗小鼠BrdU单克隆抗体1抗体(工作浓度1: 50)，阴性对照加入PBS或血清 。免疫组化常用的ABC法进行检测，苏木精或伊红染色，显微镜下随机计数10个高倍视野内的细胞总数和BrdU阳性细胞数，计算标记指数LI 。
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