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『』人工酶与定向进化的前沿与挑战( 三 )


该研究组的前期研究发现 ， 仅有约27 kD的荧光蛋白具有改造为类似天然光系统的光合蛋白质的潜能 。
首先 ， 研究发现荧光蛋白受光激发后 ， 其发色团可以生成具有高还原活性的物种 ， 这种中间体可以高效率的向位于蛋白质beta折叠桶外的电子受体传递电子 。 另一方面 ， 应用基因密码子扩展技术 ， 可以特异性地插入非天然氨基酸取代原组成发色团的酪氨酸 。 这使得研究人员可以理性设计荧光蛋白的荧光发色团化学结构 ， 优化其吸收光谱、激发态寿命、自由基还原电势等一系列光化学性质 。
设计基于荧光蛋白突变体的高效二氧化碳光还原蛋白质的核心问题在于如何延长其发色团受激发后所生成的还原性中间态的寿命 ， 降低它的还原电势 。 王江云团队选择了一种带有二苯甲酮取代基的酪氨酸类似物（BpA）来改造发色团 。 二苯甲酮是一种有机光催化中常用的光敏剂 。 当它受到一定波长的光照射时 ， 其激发态以近100%的效率系间穿越为寿命较长的三重态 。 这种三重态进而和牺牲还原剂反应生成高活性的自由基态 ， 催化下游氧化还原反应 。 基于密码子扩展方法插入BPa改造荧光蛋白的发色团后 ， 其新生成的光敏蛋白（PSP）保留了这种特性 。
瞬态吸收光谱的研究表明 ， 受光激发后 ， Bpa组成的新发色团可以几乎全部转化为三重态；在有和生物相关牺牲还原剂的存在下 ， 三重态中间体快速氧化牺牲还原剂从而生成自由基态 。 该自由基被蛋白质骨架保护 ， 因此在没有氧气存在的条件下可以稳定存在10 min以上 。 晶体结构衍射显示 ， PSP处于自由基状态时 ， 其发色团呈现出更加扩展的共平面构象 ， 这与紫外-可见吸收光谱检测得到的红移吸收结果一致 。 另一方面 ， 合成的含有BpA发色团小分子的电化学分析表明 ， 所生成的自由基态具有接近-1.5 V的还原电势 。 这不仅满足了还原CO2的需求 ， 也低于已知的天然生物还原剂 。
『』人工酶与定向进化的前沿与挑战
本文插图

通过引入非天然氨基酸构建的人工金属酶可以催化二氧化碳的还原
在获得了该光敏蛋白后 ， 研究人员进一步应用化学生物学方法在PSP蛋白表面特定位点引入了一种小分子CO2电化学还原催化剂三联吡啶镍配合物 。 这种杂合蛋白质具有在光照条件下还原二氧化碳生成一氧化碳的活性 ， 光量子产率为2.6% ， 高于大部分已报道的CO2光还原催化剂 。
总结与展望
在人工酶与定向进化领域 ， 仍存在以下挑战与前沿问题 。
1）传统上有机化学反应和酶催化的生物合成在反应条件、反应类型等方面相差较大 。 金属有机催化的发展以及在蛋白质中引入金属配合物构建人工酶的方法淡化了这种界限；同时合成化学和酶催化可实现的反应大大拓展 ， 反应类型已经有所重叠 。 合成化学与生物合成哪种方法更高效普适 ， 二者之间的碰撞必将引发催化科学的发展 。
2）许多经典的化学生物学方法 ， 如探针的构建、非天然氨基酸的引入已经成为人工酶构建的重要方法 。 例如通过非天然氨基酸的引入 ， 中国学者成功构建了利用光能固定二氧化碳的酶 ， 实现了人工的光合作用；通过手性相反的结构单元 ， 构建了镜像生物大分子 。 化学生物学方法的发展必将促进人工酶构建的进步 ， 而人工酶的研究也会促进我们对化学生物学的理解 。
3）计算方法已经成为实验科学的有力补充 ， 随着算法的进化 ， 包括量子化学与分子力学的结合 ， 人工智能在酶设计领域的应用等 ， 人工酶领域将实现“干湿结合” ， 设计更加强大的酶将成为可能 。
4）自动化大大降低了定向进化的工作量 ， 多个实验室正在开发标准化、智能化的实验室自动化系统 ， 未来将提高通量、降低人力投入 。
5）人工酶与定向进化作为工程化改造蛋白质的手段与工具 ， 与合成生物学的理念非常契合 ， 在“design-build-test-learn”循环中如何更好总结知识 ， 加深对酶的理解 ， 还需要进一步的研究 。


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