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金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？( 二 )


金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？
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第三代：单分子/纳米孔测序
测序技术在近两年中又有新的里程碑 ， Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术 ， 被认为是第三代测序技术 。 与前两代技术相比 ， 他们最大的特点是单分子测序 ， 测序过程无需进行PCR扩增 ， 其中 ， Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序 ， 而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序 。
由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷 ， 人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷 ， 第三代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理 ， 以达到直接读取序列信息的目的 ， 三代测序设备在DNA序列片段读长上优于二代设备 ， 但在准确度上较二代设备差 ， 目前尚未完全成熟 ， 市场应用面还不算广 ， 未来随着技术的改善 ， 三代测序设备将更为稳定和成熟 。
金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？
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第三代测序优势：
1）第三代基因测序读长较长 ， 如PacificBiosciences公司的PACBIORSII的平均读长达到10kb ， 可以减少生物信息学中的拼接成本 ， 也节省了内存和计算时间 。
2）直接对原始DNA样本进行测序 ， 从作用原理上避免了PCR扩增带来的出错 。
3）拓展了测序技术的应用领域 ， 二代测序技术大部分应用基于DNA ， 三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列 ， RNA的直接测序 ， 将大大降低体外逆转录产生的系统误差 。 第二个是直接测甲基化的DNA序列 。 实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的 。 正常的C或者甲基化的C为模板 ， DNA聚合酶停顿的时间不同 ， 根据这个不同的时间 ， 可以判断模板的C是否甲基化 。
4）三代测序在ctDNA ， 单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低 ， 三代测序技术灵敏度高 ， 能够对于1ng以下做到监测；在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序 ， 三代测序直接对原始DNA测序 ， 细胞裂解原位测序 ， 是三代测序的杀手应用 。
第三代测序缺陷：
【金岱基因|能说说测序仪的测序技术和原理是什么吗？】1）总体上单读长的错误率依然偏高 ， 成为限制其商业应用开展的重要原因；第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40% ， 极大地高于二代测序技术NGS的错误率（低于1%） 。 不过好在三代的错误是完全随机发生的 ， 可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本） 。
2）三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性 。
3）成本较高 ， 二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元 ， 三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元 。
4）生信分析软件也不够丰富 。
三代测序和二代测序相比较 ， 第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降 ， 通量大大提升 ， 但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率 ， 并且具有系统偏向性 ， 同时读长也比较短 。 第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的 ， 它的根本特点是单分子测序 ， 不需要任何PCR的过程 ， 这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误 ， 三代读长超长 ， 准确低 ， 费用高 ， 但因读长长 ， 利于组装和发现uniquereads潜在优势明显 ， 但是劣势也限制了三代测序的商业应用 。
未来前景
目前 ， 第二代的基因测序技术高通量测序（NGS）是市场商用主流 。 第三代的单分子/纳米孔测序将是未来的大势所趋 ， 但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存 ， 但二代测序仍将是测序市场商业应用主流 。


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