人类首次，人工重建出活的新冠病毒
近日 ， 瑞士一个科研团队在已知新冠病毒基因序列的基础上 ， 通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病毒 。 该技术能高效合成新冠病毒 ， 尤其在新暴发病毒尚未被成功分离出之前 ， 可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株 ， 且该替代方案更为高效、安全 。 以上成果披露自预印本网站BioRxiv于当地时间2月21日发表了一篇名为“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”的论文 。 该尚未经同行审议 。 研究团队首次在试验中 ， 利用合成基因组学平台快速重建了新冠病毒 。 值得注意的是 ， 这是一项根据已知病毒基因组进行病毒重建的基础研究工作 ， 该成果与此前的谣言之一“新冠病毒是人工合成的” 无关 ， 本研究中实验室中构建的新冠病毒是在疫情暴发后 ， 根据已经公布的病毒基因组序列进行的病毒重建研究 。 该项研究的作者大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家 ， 他们联合德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构共同完成了上述成果 。 研究团队认为 ， 利用已知的病毒基因组序列 ， 通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病毒 ， 可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病毒毒株的替代方法 ， 还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征 ， 从而争取时间对疫情暴发做出快速反应 。 论文中提到 ， 反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具 ， 它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识 。 大型的RNA病毒基因组 ， 如冠状病毒基因组 ， 由于基因组较大且不稳定 ， 很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作 。 研究团队此次报道了一个基于酵母的合成基因组学平台 ， 用于多种RNA病毒的基因重建 ， 包括冠状病毒科、黄病毒科和副粘病毒科的成员 。 研究人员可利用病毒分离物、克隆病毒DNA、临床样本或合成DNA生成病毒亚基因组片段 ， 然后使用转化偶联重组技术 (TAR)克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体（YAC） ， 从而在酿酒酵母中实现一步重组 。 T7-RNA聚合酶被用于产生病毒RNA ， 进而可以产生活病毒 。 研究团队首先在其他RNA病毒（如鼠肝炎病毒MHV）中检验了这一平台的准确度 ， 团队测试了鼠肝炎病毒A59株中含有绿色荧光蛋白（MHV GFP）的基因克隆能力 ， 结果表明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90％ ， 这表明病毒在酵母中的组装效率很高 。 也正是利用该平台 ， 研究人员在拿到合成DNA片段后一周内 ， 对新冠病毒进行了工程改造和复活 。
中从而在总计有14个片段 。 研究团队让试剂公司化学合成上述14个DNA片段 ， 1月14日下订单 ， 2月4日拿到其中的12个片段 。 片段5和7在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成 。 不过 ， 研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病毒样本（SARS-CoV-2/München1.1/2020/929） ， 他们决定利用RT-PCR扩增获得片段5和片段7 。 利用TAR克隆 ， 对于所有6种新冠病毒构建体 ， 研究人员都获得了正确组装的分子克隆 。 随后 ， 利用转化偶联重组技术 (TAR) ， 用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列 ， 将这些DNA序列拼到一起 。 获得完整的病毒序列后 ， 用T7 RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病毒RNA ， 将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6（猴肾细胞）中 ， 使得细胞被感染 ， 培养这些细胞的上清液（含释放出的病毒颗粒）注入到别的培养基中 ， 可以感染别的细胞 。 研究团队进而表示 ， “我们能在获取病毒的合成DNA片段后仅一周的时间内 ， 对最近流行的新冠病毒的化学合成克隆进行工程改造和复活 。 ”病毒的重组有很高的效率和准确度 ， 通常情况下 ， 超过90%的克隆是正确的 。 值得注意的是 ， 作者们指出 ， 尽管此前在酵母中进行同源重组已被用于很多分子病毒的克隆 ， 但这一研究在对通过这种方法快速生成大型RNA病毒的全长cDNA的可行性进行了全面评估 ， 尤其是这种大型RNA病毒在大肠杆菌中无法被稳定克隆 。 <p style=)
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