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稳定细胞系构建 细胞株构建


稳定细胞系构建 细胞株构建

文章插图
细胞构建(稳定的细胞系构建)
构建稳定细胞植物信息资源网络的常设技术方法
1.基因过表达稳定细胞系的构建
(基因过表达多克隆细胞系构建服务，基因过表达单克隆细胞系构建服务):
过表达细胞系构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体的构建、病毒包装、细胞转染和筛选 。客户只需提供目的基因的cDNA质粒和待构建的细胞系 。我们将根据您的要求完成目的基因过表达细胞系的构建和检测，为您提供高质量的基因过表达稳定细胞系 。
2.RNA基因敲除稳定细胞系的筛选
【稳定细胞系构建 细胞株构建】(RNA干扰基因敲除细胞克隆构建服务，RNA干扰基因敲除细胞克隆构建服务):
我们的RNAi基因敲除细胞系构建基于慢病毒表达系统 。通常，由U6启动子驱动的pLVshRNA-puro或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体用于构建RNA干扰稳定的细胞系 。这些服务包括干扰载体构建、目标筛选、干扰效率验证、稳定细胞筛选和克隆 。
3.CRISPR基因敲除稳定细胞系构建服务信息资源网络:
随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，基因定点敲除的难度大大降低 。新技术逐渐将基因敲除从昂贵耗时的ZNF系统变成简单的研究工具 。目前可以提供Talen和Cas9/gRNA系统的基因敲除服务 。包括基因敲除靶设计、TALEN质粒组装、Cas9/gRNA质粒构建和基因敲除效率验证 。
稳定细胞系筛选方法
1.质粒转染后，用单克隆方法筛选稳定的细胞系:
大多数细胞的转染效率较低 。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达是可以接受的 。但对于基因干扰实验，转染效率的要求远高于基因过表达，质粒转染通常无法满足 。
另外，质粒游离于细胞质外，降解快，不能满足长期试验项目 。质粒转染整合的概率极低，稳定细胞系的构建费时费力，产量很低，往往需要选择单克隆菌株 。
2.筛选病毒感染的稳定细胞系:
病毒感染法比质粒转染筛选单克隆法更方便高效，是稳定细胞系的主流筛选方法 。慢病毒具有高整合、高转录、高表达、宿主范围广、感染效率高、与细胞染色体整合而不发生基因重排等特点，是制备稳定细胞系的理想载体 。
稳定细胞株通用服务流程
1.载体构建和病毒包装
一般来说，将人源化抗体基因转移到慢病毒载体中，然后检测质粒的表达，包装得到过量表达目的基因的慢病毒质粒 。将慢病毒载体系统的包装成分与用于包装的载体成分一起转染到293细胞中；24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩并测试滴度 。
图1病毒包装和细胞感染
2.细胞转染
常用的真核表达载体的抗性标记有嘌呤霉素、潮霉素和新霉素 。首先确定嘌呤霉素/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后将病毒悬液转染细胞24h 。用嘌呤霉素/G418筛选稳定的转化菌株，用ELISA和WB法鉴定 。
3.单克隆
利用分子ClonePix2系统，高通量自动筛选出100-200个高水平分泌克隆，选择信息资源网最佳的10个高产克隆进行下一步的稳定性试验 。
4.细胞系的稳定筛选 。
细胞传了几代后，可能会出现遗传不稳定性 。筛选出10个最佳克隆，传代10次后，用qPCR和WB法检测细胞系的稳定性 。最后，我们提供了序列和载体报告、三个最佳表达细胞系、表达分析、稳定性测试报告和详细的稳定细胞系构建报告 。


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