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lncRNA的套路分析 lncrna引物设计


lncRNA的套路分析 lncrna引物设计

文章插图
lncrna引物的设计(lncRNA的常规分析)
摘要
非编码RNA (ncRNA)参与表观遗传调控，但对其知之甚少 。在这里，我们以5个碱基对的分辨率描述了11个解剖位点的4个人HOX基因座的转录景观特征，并鉴定了231个HOX ncRNAs，其将已知的转录区域扩展了30千个碱基 。Honcrnas沿着发育轴空表达，并具有独特的序列基序 。它的表达定义了一系列区分组蛋白甲基化和RNA聚合酶可及性的染色体结构域 。
研究成果
图1
图1:位于1:HOXA基因座的人类HOX转录组 。
(a)位点特异性转录 。左图:50，532个探针的杂交强度，这些探针拼接了11个样品中每个样品的人类HOXA基因座(用圆圈编号) 。每个探针的强度显示为单个探针的强度除以阵列上所有301，027个探针的平均强度的log2的比值；每个探针的log2比率取100 bp窗口的平均值；红色和绿色条形分别高于或低于阵列平均值 。编码HOX蛋白的基因的基因组位置显示在棕色方框中 。右图:关于发育轴的11个成纤维细胞样本的解剖学来源 。
(b)通过瓦片阵列上的连续信号识别转录区域，然后与Refseq序列比较，以确定基因[外显子(粉色)和内含子(蓝色)]和基因间转录区域(紫色) 。每个预测的HOX外显子或内含子分别命名为HOXn或int-HOXn 。基因间转录区被命名为nchoxn，其中n是位于HOX编码链上NC RNA 3’端的HOX旁系同源物 。
(c)所有四个HOX基因座的转录区域的总结，定义HOX基因、内含子和ncRNA的转录区域的数量 。
图2
图2:HOX ncRNA在信息资源网络中的位点特异性表达和一级序列基序 。
(a)由HOX编码的转录物沿近端-远端轴差异表达 。60个转录区(12个HOX基因和48个ncRNA)在远端成纤维细胞样品(足、手指、包皮和前列腺)和所有其他细胞之间差异表达(P < 0.05，学生t检验) 。高于或低于总体中位数的每个转录区的表达水平用色标表示(在线信息资源的在线标度为3至0.3倍，或log2标度为+1.6至-1.6倍) 。转录区域根据它们在染色体上的位置进行分类，样品根据这60个转录物表达的相似性进行分级聚类 。HOX的侧枝同源基因是从飞越胸部(UBX)或天线腹部(Antp)进化而来，分别用蓝色和黄色方框表示 。
(b)由HOX编码的转录物沿着前部和后部解剖区域差异表达 。总共92个转录物(6个HOX基因，86个ncRNA)在原代前或原代后成纤维细胞培养物(脐上方或下方)中差异表达(P < 0.05，学生t检验) 。每个ncRNA的表达如(a)所示 。
(c)基于其表达模式，序列基序在HOX ncRNA中富集(p < 10-9) 。ncRNAs一级序列中富集序列基序的语码图比未翻译的HOX序列多，或者位于表达模式信息资源网络的远、近或后 。在前面解剖部位表达的ncRNA中，没有比预期更多的一级序列基序 。
【lncRNA的套路分析 lncrna引物设计】图3
图Suz12、H3K27me3和pol II在HOXA基因座占据的染色质修饰和转录可及性，这与原代肺(上)或足(下)成纤维细胞(Fb)的HOXA基因座的~100 kb转录活性完全相反 。对于码片数据，码片/输入的log2比率绘制在Y轴上 。对于RNA数据，杂交强度以线性比例显示 。虚线突出了染色质修饰和基因之间转录的相反配置之间的边界 。
图4
图4:在4:HOXC位点的反义基因之间的长ncRNA HOTAIR 。
(a)热空气在两个染色质域边界的基因组位置 。拼接阵列上芯片RNA的表达如图3所示 。
(b)链特异性RT-PCR显示HOTAIR在HOXC基因的相对链中的独特表达(底部) 。设计用于逆转录(P-RT)和PCR(P-PCR)的引物以特异性靶向HOTAIR的顶部链(引物F1-F3)或底部链(引物R1) 。
(c)肺和包皮成纤维细胞RNA中热空气体的Northern印迹分析 。
(d)通过含有HOTAIR、全长反义HOTAIR或miRNA let7a探针的寡核苷酸库(组1-3)检测小RNA的小片段和大片段 。
(e)通过qrtpcr检测HOTAIR在人成纤维细胞后部和远端的表达 。每个成纤维细胞样本的来源由解剖卡通上的样本号表示 。" A "来自头皮 。X轴上显示了相对于头皮(正面)的每个位置的热空气的相对丰度 。
(f)在胚胎10.5天时，使用HOTAIR sense(下链)或antest(上链)探针在整个胚胎(上链)和后肢和尾巴(左下和右下)中进行整个胚胎的原位杂交 。突出显示HOTAIR后肢(箭头)和尾巴(箭头)的表情 。
图5
图H3K27的三甲基化和Suz12在5:HOXD位点的占据需要HOTAIR 。
(a)与针对GFP的对照siRNA相比，hoxd基因座中H3K27me3芯片-芯片信号的变化是由HOTAIR的缺失引起的 。HOXD基因的位置用棕色方框表示 。
(b) Suz12，靶向GFP或HOTAIR的siRNA处理后H3K27me3的ChIP和HOXD的位点选择性启动子 。下图:芯片检测定量(平均标准误差) 。


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