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环境中微生物生物量的测定

环境中微生物生物量的测定
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微生物量的测定可以反映水生化处理系统中生物生长情况 ， 运行是否正常 。 而对环境的卫生检验则反映环境污染的情况 。 生物量主要是直接或间接测定细菌群体的细胞数量或重量、原生质及细胞中某些代谢活动的变化等 。
一、细菌活菌数的测定
1．平板菌落计数法
平板菌落计数法是根据在固体培养基上生长的菌落计数 ， 每一个菌落由一个单细胞繁殖而成 ， 为肉眼可见的细胞群体 。 根据菌落数可以计算出待测菌液中的活菌数量 。
（1）取水样1ml利用无菌水按10倍数作一系列稀释 ， 水样稀释浓度以在平板上长出的菌落数在30～300个之间为宜 。 稀释时应尽量使微生物细胞分散开 ， 否则易生长出片状菌苔 。 稀释过程参考实验五 。
（2）以无菌操作用无菌移液管吸取1ml充分混匀的水样 ， 注入无菌平皿中 ， 再倾入约15ml已融化并冷却到45℃的营养琼脂培养基 ， 迅速转动 ， 使水样与培养基充分混匀 。
（3）置水平位置静止凝固后 ， 倒置于37℃下培养24小时 。 每个水样取3个连续适宜稀释菌液倒平板 ， 各倾注3个平皿 ， 同时做不加水样空白对照 。
（4）待菌落生长好取出平皿计数 ， 统计出同一稀释度一个平皿上菌落的平均数 。 根据以下公式计算：每毫升菌液中活菌总数＝同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数 。
（5）菌落计数原则：先计算相同稀释度的平均菌落数 。 若其中一个平皿有较大片状的菌苔生长时 ， 则不宜采用 ， 而应以无片菌苔的平皿作为该稀释度的平均菌落数 。 若片状菌苔不到平皿的一半 ， 而其余一半中菌落数分布又很均匀 ， 可将此一半平皿计数后乘2以代表全皿菌落数 。
首先选择平均菌落数在30～300之间的 ， 当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时 ， 则以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告之（表10-1中例1） 。
若有两个稀释度 ， 其平均菌落数均在30～300之间 ， 应按两者菌落总数之比值来决定 。 若其比例小于2应报告两者的平均数 ， 若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（表10-1中例2、例3） 。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300 ， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（表10-1中例4） 。 若所有稀释度的平均数均小于30 ， 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（表10-1中例5） 。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间 ， 则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（表10-1中例6） 。
菌落计数报告 ， 菌落数在100以内按实有数报告 ， 大于100时采用两位有效数字 ， 在两位有效数字后面的值 ， 以四舍五入方法计算 ， 为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（表10-1中“报告方式”栏） 。 在报告“菌落无法计数”时 ， 应注明水样的稀释倍数 。
表10-1计算细菌菌落总数方法的示例
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（6）细菌总数测定方法的改进 。 依上述方法观察计数 ， 但深层较小菌落容易遗漏 ， 造成计数上误差较大 。 由于多数细菌具有脱氢酶 ， 在培养皿中产生脱氢作用 ， 遇到氯化三苯基四氮唑（TTC）在平板上显现深浅不同红色小点或红色片状物均为细菌 。 TTC的投加量以0.01％及0.04％为宜 ， 切忌TTC浓度过高 ， 否则对细菌具有抑制作用 。
使用该改进方法时 ， 要注意如下情况：①要注意选择好倒平板的稀释度 ， 一般以3个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好；②由3个稀释度（10－4、10－5、10－6）计算出的每毫升菌液中总活菌数应很接近 ， 如相差较大 ， 表示试验不准确 ， 应重做 。
2．液体稀释法（MPN法）
此法也可进行活菌数计算 ， 由于某些微生物在琼脂平板上不易生长 ， 故不适用平板菌落计数 ， 但在液体培养基中生长易于检查 。 因此 ， 根据某些稀释菌液接种培养后所生长微生物的试管数 ， 用统计数学方法计算出原样品的含菌量 ， 此法也称为最或然数技术或最大可能数量法 ， 简称MPN法 。 反硝化细菌、氨化细菌、类大肠杆菌及紫色非硫光合细菌均可利用此法计数 。
操作时先将样品作一系列的10倍稀释 ， 至最后一级稀释液接种后 ， 不出现菌的生长为临界级数 。 取后5种稀释液接种于无菌的液体培养基中 ， 一般需做3～5管平行实验 。 适温培养 ， 根据生长菌试管数 ， 确定数据指标 ， 查出菌的近似值 ， 再行计算 。
下面以5管平行实验为例来介绍检验方法 。 其他3管、4管平行实验同理依次查表计算 ， 一般要根据实验精确度要求选择管数 ， 一般用3管平行实验即可 。
（1）取1ml样品 ， 按10倍作一系列稀释至10－10 。
（2）利用无菌移液管分别从不同浓度稀释液中各取1ml ， 分别接种到5支已灭菌液体培养基试管中 。 适温培养2～14天 ， 记录每个稀释液出现细菌生长的试管数来确定数量指标 。 注意每种稀释度必须更换一支移液管 。
（3）数量指标的确定 ， 不论重复系数多少均取3位数字 。
1）如果生长情况如下：
表10-2生长情况表一
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【环境中微生物生物量的测定】取各重复管数都有菌生长的最高稀释度的生长管数 ， 为数量指标的第一个数字 ， 其后两个稀释度的生长管数作为其他的个数 。 就上例4个重复生长的有10－3及10－4两个稀释度 ， 取其中高稀释度10－4 ， 其中生长管数“4”作为数量指标的第一位数字；10－5为3及10－6为1 ， 因此所得数量指标为4、3、1 。
2）如果生长情况如下：
表10-3生长情况表二
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依原则1）数量指标第一数字应取10－4的4 ， 其后两个数字是“2”和“1” ， 可是更高稀释度10－7中还有1管生长 ， 因而需将这个管加在第三个数上 ， 所以数量指标数为4、2、2 。
3）如果生长情况如下：
表10-4生长情况表三
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所取数量指标应使有生长菌的管数位于中间 。
确定数量指标后查附表1得出菌近似值 。
（4）计算方法 。 利用以下公式计算原菌液的最大可能数 。
1ml（g）样品中的菌数＝菌近似值×数量指标第一位数的稀释倍数 。
3．滤膜过滤计数法
当单位体积水样中所含微生物数量较少时 ， 可通过超滤膜过滤浓集后 ， 再进行培养计数 。
（1）滤膜主要是由硝化纤维制成的白色薄膜 ， 根据实验要求可选择不同大小的孔径及直径 。 使用前应先经灭菌处理 ， 将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中 ， 置于沸水浴中煮沸灭菌3次 ， 每次15分钟 。 前两次煮沸后需更换水洗涤3次 ， 以除去残留溶剂 。
（2）利用无菌镊子取滤膜 ， 安装于过滤器上 ， 将过滤器装于抽滤瓶上 ， 并与真空泵相连接 。
（3）取适量水样放入过滤器漏斗内过滤 ， 若水样量少应加无菌水稀释、混匀过滤 ， 过滤水样多少根据漏斗直径决定 。 开动真空泵抽滤 ， 使水样中微生物被截留在滤膜上 。 待水样全部滤完 ， 立即停止抽滤 。
（4）打开滤器 ， 利用无菌镊子取下滤膜 ， 过滤面向上放于平板培养基上 ， 使滤膜与培养基之间贴紧 ， 不可留有气泡 。 盖好培养皿盖 ， 倒置适温培养 ， 若培养时间较长可将小培养皿放于铺有湿脱脂棉的大培养皿内 ， 以保持皿内湿度 。 每个水样做3个平皿培养 。 计算膜上菌落数 ， 取平均值 ， 计算出每毫升水样的含菌数 。
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